Merci fir Äre Besuch op nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, huet limitéiert CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech déi lescht Browserversioun ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, ass dës Säit fräi vu Stiler a JavaScript.
Skelettmuskel ass en heterogent Gewief, dat haaptsächlech aus Myofibrillen zesummegesat ass, déi beim Mënsch typescherweis an dräi Typen agedeelt ginn: eng "lues" (Typ 1) an zwou "schnell" (Typen 2A an 2X). Wéi och ëmmer, ass d'Heterogenitéit tëscht an bannent traditionellen Myofibriltypen nach ëmmer schlecht verstanen. Mir hunn transkriptomesch a proteomesch Approchen op 1050 respektiv 1038 individuell Myofibrillen aus dem mënschleche Vastus lateralis ugewannt. D'Proteomikstudie huet Männer abegraff, an d'Transkriptomikstudie 10 Männer an 2 Fraen. Zousätzlech zu Myosin-Schwéierkette-Isoformen hu mir metabolesch Proteinen, ribosomal Proteinen a zellulär Junctionalproteinen als Quelle vun der multidimensionaler Intermyofibril-Variabilitéit identifizéiert. Ausserdeem, trotz der Identifikatioun vu Cluster vu luesen a schnelle Faseren, suggeréieren eis Donnéeën, datt Typ 2X Faseren phenotypesch net vun anere séier-zuckende Faseren z'ënnerscheeden sinn. Ausserdeem ass d'Klassifikatioun op Basis vu Myosin-Schwéierketten net genuch fir de Myofaster-Phänotyp bei nemaline Myopathien ze beschreiwen. Am Allgemengen deiten eis Donnéeën op multidimensional Myofaser-Heterogenitéit hin, mat Variatiounsquellen, déi iwwer d'Isoforme vu Myosin-Schwéierketten erausginn.
Zellulär Heterogenitéit ass eng inherent Charakteristik vun alle biologesche Systemer, déi et Zellen erlaabt sech ze spezialiséieren, fir déi verschidde Bedierfnesser vu Gewëss an Zellen ze erfëllen.1 Déi traditionell Vue op d'Heterogenitéit vu Skelettmuskelfaseren war, datt Motorneuronen den Fasertyp an enger Motoreenheet definéieren, an datt den Fasertyp (dh Typ 1, Typ 2A an Typ 2X beim Mënsch) duerch d'Charakteristike vun de Myosin-Schwéierkette (MYH)-Isoformen bestëmmt gëtt.2 Dëst baséiert ufanks op hirer pH-ATPase-Instabilitéit,3,4 a spéider op hirer molekularer Expressioun vu MYH.5 Wéi och ëmmer, mat der Identifikatioun an der spéiderer Akzeptanz vu "gemëschte" Faseren, déi verschidde MYHs a variéierende Proportiounen zesumme expriméieren, ginn Skelettmuskelfaseren ëmmer méi als e Kontinuum ugesinn anstatt als ënnerschiddlech Fasertypen.6 Trotzdeem baséiert sech d'Fuerschung ëmmer nach staark op MYH als primäre Klassifizéierer fir d'Myofaserklassifikatioun, eng Vue, déi wahrscheinlech vun de Limitatiounen a bedeitende Viruerteeler vu fréie Nagetierstudien beaflosst gëtt, deenen hir MYH-Expressiounsprofiler an d'Palette vu Fasertypen sech vun deenen beim Mënsch ënnerscheeden.2 D'Situatioun gëtt weider komplizéiert duerch d'Tatsaach, datt verschidde mënschlech Skelettmuskelen eng divers Palette vu Fasertypen opweisen.7 Den De vastus lateralis ass e gemëschte Muskel mat engem intermediären (an dofir representativen) MYH-Expressiounsprofil.7 Ausserdeem mécht seng einfach Proufnahme en zum am beschten ënnersichte Muskel beim Mënsch.
Dofir ass eng onparteiesch Untersuchung vun der Diversitéit vun de Skelettmuskelfaseren mat Hëllef vu mächtege "Omiks"-Tools entscheedend, awer och eng Erausfuerderung, deelweis wéinst der multinuklearer Natur vun de Skelettmuskelfaseren. Wéinst verschiddenen technologesche Fortschrëtter hunn d'Transkriptomik8,9- an d'Proteomik10-Technologien an de leschte Joren eng Revolutioun an der Sensibilitéit erlieft, déi d'Analyse vu Skelettmuskelen mat enger Opléisung vun enger Faser erméiglecht hunn. Als Resultat goufen bedeitend Fortschrëtter bei der Charakteriséierung vun der Diversitéit vun enger Faser an hirer Reaktioun op atrophesch Stimuli an Alterung11,12,13,14,15,16,17,18 gemaach. Wichteg ass, datt dës technologesch Fortschrëtter klinesch Uwendungen hunn, déi eng méi detailléiert a präzis Charakteriséierung vun der krankheetsassoziéierter Dysreguléierung erméiglechen. Zum Beispill ass d'Pathophysiologie vun der Nemaline-Myopathie, eng vun den heefegsten ierfleche Muskelkrankheeten (MIM 605355 an MIM 161800), komplex a verwirrend.19,20 Dofir kéint eng besser Charakteriséierung vun der Dysreguléierung vun de Skelettmuskelfaseren zu bedeitende Fortschrëtter an eisem Verständnis vun dëser Krankheet féieren.
Mir hunn Methoden fir d'transkriptomesch an d'proteomesch Analyse vun eenzelne Skelettmuskelfaseren entwéckelt, déi manuell aus mënschleche Biopsie-Prouwen isoléiert goufen, an se op Dausende vu Faseren ugewannt, wat eis erlaabt huet, d'zellulär Heterogenitéit vun de mënschleche Skelettmuskelfaseren z'ënnersichen. Am Laf vun dëser Aarbecht hu mir d'Kraaft vun der transkriptomescher a proteomescher Phenotypiséierung vu Muskelfaseren demonstréiert an metabolesch, ribosomal a zellulär Junctionalproteinen als bedeitend Quelle vun der Interfaservariabilitéit identifizéiert. Ausserdeem hu mir mat dësem proteomesche Workflow déi klinesch Relevanz vun der Nematodenmyopathie an eenzelne Skelettmuskelfaseren charakteriséiert, wat e koordinéierte Verschiebung a Richtung net-oxidative Faseren onofhängeg vum Fasertyp baséiert op MYH opgedeckt huet.
Fir d'Heterogenitéit vu mënschleche Skelettmuskelfaseren z'ënnersichen, hu mir zwou Workflows entwéckelt, fir d'Transkriptom- a Proteomanalyse vun eenzelne Skelettmuskelfaseren z'erméiglechen (Figur 1A an Ergänzungsfigur 1A). Mir hunn e puer methodologesch Schrëtt entwéckelt an optimiséiert, vun der Proufspäicherung an der Erhaalung vun der RNA- an dem Proteinintegritéit bis zur Optimiséierung vum Duerchsatz fir all Approche. Fir d'Transkriptomanalyse gouf dëst erreecht andeems probespezifesch molekular Barcoden am éischte Schrëtt vun der Récktranskriptioun agefouert goufen, sou datt 96 Faseren fir eng effizient Downstream-Veraarbechtung zesummegefaasst konnten ginn. Eng méi déif Sequenzéierung (±1 Millioun Liesungen pro Faser) am Verglach mat traditionellen Eenzelzell-Approchen huet d'Transkriptomdaten weider beräichert.21 Fir d'Proteomik hu mir e kuerze chromatographesche Gradient (21 Minutten) a Kombinatioun mat der DIA-PASEF-Datenerfassung op engem timsTOF-Massenspektrometer benotzt, fir d'Proteomdéift ze optimiséieren, wärend en héijen Duerchsatz bäibehale gëtt. 22,23 Fir d'Heterogenitéit vu gesonde Skelettmuskelfaseren z'ënnersichen, hu mir d'Transkriptome vun 1.050 eenzelne Faseren aus 14 gesonden erwuessene Spender an d'Proteome vun 1.038 Faseren aus 5 gesonden erwuessene Spender charakteriséiert (Ergänzungstabell 1). An dëser Aarbecht ginn dës Datensätz als 1.000-Faseren-Transkriptome respektiv Proteome bezeechent. Eis Approche huet insgesamt 27.237 Transkripten an 2.983 Proteinen an den 1.000-Faseren-transkriptomeschen a proteomeschen Analysen detektéiert (Figur 1A, Ergänzungsdatensätz 1-2). Nodeems d'transkriptomesch a proteomesch Datensätz fir >1.000 detektéiert Genen a 50% gülteg Wäerter pro Faser gefiltert goufen, goufen duerno bioinformatesch Analysen fir 925 respektiv 974 Faseren am Transkriptom a Proteom duerchgefouert. Nom Filteren goufen am Duerchschnëtt 4257 ± 1557 Genen an 2015 ± 234 Proteinen (Moyenne ± SD) pro Faser detektéiert, mat limitéierter Variabilitéit tëscht den eenzelne Persounen (Ergänzungsfiguren 1B–C, Ergänzungsdatensätz 3–4). D'Variabilitéit bannent de Probanden war awer méi ausgeprägt bei de Participanten, wahrscheinlech wéinst Ënnerscheeder am RNA/Protein-Ausbezuelung tëscht Fasere vu verschiddene Längt a Querschnittsflächen. Fir déi meescht Proteinen (>2000) louch de Variatiounskoeffizient ënner 20% (Ergänzungsfigur 1D). Béid Methoden hunn et erlaabt, e breede dynamesche Beräich vun Transkripten a Proteinen mat héich expriméierte Signaturen ze erfassen, déi fir d'Muskelkontraktioun wichteg sinn (z.B. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Ergänzungsfiguren 1E–F). Déi meescht vun den identifizéierten Eegeschafte ware gemeinsam tëscht den transkriptomeschen a proteomeschen Datensätz (Ergänzungsfigur 1G), an déi duerchschnëttlech UMI/LFQ-Intensitéiten vun dëse Funktiounen ware relativ gutt korreléiert (r = 0,52) (Ergänzungsfigur 1H).
Transkriptomik- a Proteomik-Workflow (erstellt mat BioRender.com). BD Dynamesch-Beräichkurven fir MYH7, MYH2 an MYH1, a berechent Schwellenwäerter fir d'Zouweisung vun der Fasertyp. E, F Verdeelung vun der MYH-Expressioun iwwer Faseren an Transkriptomik- a Proteomik-Datensätz. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-Diagrammer fir Transkriptomik a Proteomik, déi no MYH-baséiertem Fasertyp gefierft sinn. I, J Feature-Diagrammer, déi d'MYH7-, MYH2- an MYH1-Expressioun an Transkriptomik- a Proteomik-Datensätz weisen.
Mir hunn ufanks virgeholl, all Faser en op MYH baséierten Fasertyp zouzeweisen, andeems mir eng optiméiert Approche benotzt hunn, déi d'Virdeeler vun der héijer Empfindlechkeet an dem dynamesche Beräich vun der MYH-Expressioun an Omics-Datensätz ausnotzt. Fréier Studien hunn arbiträr Schwellenwäerter benotzt fir Faseren als reng Typ 1, Typ 2A, Typ 2X oder gemëscht ze markéieren, baséiert op engem fixe Prozentsaz vun der Expressioun vu verschiddene MYHs11,14,24. Mir hunn eng aner Approche benotzt, bei där d'Expressioun vun all Faser no de MYHs klasséiert gouf, déi mir benotzt hunn, fir d'Faseren ze tippen: MYH7, MYH2 a MYH1, déi den Typ 1, Typ 2A respektiv Typ 2X Faseren entspriechen. Mir hunn dann mathematesch den ënneschten Inflektiounspunkt vun all resultéierender Kurve berechent an en als Schwellenwäert benotzt, fir Faseren als positiv (iwwer dem Schwellenwäert) oder negativ (ënner dem Schwellenwäert) fir all MYH zouzeweisen (Figur 1B-D). Dës Donnéeë weisen, datt MYH7 (Figur 1B) an MYH2 (Figur 1C) méi ënnerschiddlech On/Off-Expressiounsprofiler op RNA-Niveau hunn am Verglach zum Proteinniveau. Tatsächlech hunn um Proteinniveau ganz wéineg Faseren MYH7 net expriméiert, a keng Faser hat 100% MYH2-Expressioun. Mir hunn duerno virbestëmmt Expressiounsschwellen benotzt fir MYH-baséiert Fasertypen un all Faseren an all Datesaz zouzeweisen. Zum Beispill goufen MYH7+/MYH2-/MYH1- Faseren dem Typ 1 zougewisen, während MYH7-/MYH2+/MYH1+ Faseren dem gemëschten Typ 2A/2X zougewisen goufen (kuckt d'Ergänzungstabell 2 fir eng komplett Beschreiwung). Wann mir all Faseren zesummegefaasst hunn, hu mir eng bemierkenswäert ähnlech Verdeelung vun MYH-baséierte Fasertypen souwuel um RNA- (Figur 1E) wéi och um Protein- (Figur 1F) Niveau observéiert, während déi relativ Zesummesetzung vun MYH-baséierte Fasertypen tëscht Individuen variéiert huet, wéi erwaart (Ergänzungsfigur 2A). Déi meescht Fasere goufen entweder als reng Typ 1 (34–35%) oder Typ 2A (36–38%) klasséiert, obwuel eng bedeitend Zuel vu gemëschten Typ 2A/2X Faseren och detektéiert gouf (16–19%). En opfällegen Ënnerscheed ass, datt reng Typ 2X Faseren nëmmen op RNA-Niveau nogewise konnte ginn, awer net op Proteinniveau, wat drop hiweist, datt déi séier MYH-Expressioun op d'mannst deelweis posttranskriptionell reguléiert ass.
Mir hunn eis proteomik-baséiert MYH-Fasertypéierungsmethod mat Antikörper-baséiertem Dot Blotting validéiert, an zwou Methoden hunn eng 100% Iwwereneestëmmung bei der Identifikatioun vu puren Typ 1- an Typ 2A-Faseren erreecht (kuckt Ergänzungsfigur 2B). Wéi och ëmmer, war den proteomik-baséierten Usaz méi sensibel, méi effizient bei der Identifikatioun vu gemëschte Faseren a bei der Quantifizéierung vum Undeel vun all MYH-Gen an all Faser. Dës Donnéeën demonstréieren d'Effektivitéit vun der Notzung vun engem objektiven, héichsensiblen omik-baséierten Usaz fir d'Charakteriséierung vun Skelettmuskelfasertypen.
Mir hunn dann déi kombinéiert Informatioun, déi vun der Transkriptomik a Proteomik geliwwert gouf, benotzt fir Myofaseren objektiv op Basis vun hirem komplette Transkriptom oder Proteom ze klassifizéieren. Mat der UMAP-Method (Uniform Manifold Approximation and Projection) fir d'Dimensionalitéit op sechs Haaptkomponenten ze reduzéieren (Ergänzungsfiguren 3A-B), konnten mir d'Variabilitéit vun de Myofaseren am Transkriptom (Figur 1G) a Proteom (Figur 1H) visualiséieren. Bemierkenswäert ass, datt d'Myofaseren weder no Participanten (Ergänzungsfiguren 3C-D) nach no Testdeeg (Ergänzungsfigur 3E) an den Transkriptomik- nach Proteomik-Datensätz gruppéiert goufen, wat drop hiweist, datt d'Variabilitéit vun de Skelettmuskelfaseren bannent de Probanden méi héich ass wéi d'Variabilitéit tëscht de Probanden. Am UMAP-Diagramm sinn zwou verschidde Cluster opgetrueden, déi "séier" a "lues" Myofaseren representéieren (Figuren 1G-H). MYH7+ (lues) Myofasern ware sech um positive Pol vun UMAP1 zesummegefaasst, während MYH2+ an MYH1+ (séier) Myofasern um negativen Pol vun UMAP1 zesummegefaasst waren (Figuren 1I–J). Allerdéngs gouf keen Ënnerscheed tëscht séier-zuckende Fasertypen (dh Typ 2A, Typ 2X oder gemëschten 2A/2X) baséiert op der MYH-Expressioun gemaach, wat drop hiweist, datt d'Expressioun vu MYH1 (Figur 1I–J) oder aner klassesch 2X Myofasermarker wéi ACTN3 oder MYLK2 (Ergänzungsfiguren 4A–B) net tëscht verschiddene Myofasertypen ënnerscheet, wann een dat ganzt Transkriptom oder Proteom betruecht. Ausserdeem, am Verglach mat MYH2 an MYH7, ware wéineg Transkripten oder Proteinen positiv mat MYH1 korreléiert (Ergänzungsfiguren 4C–H), wat drop hiweist, datt d'Heefegkeet vu MYH1 net vollstänneg de Myofaser-Transkriptom/Proteom reflektéiert. Ähnlech Conclusiounen goufen erreecht, wann d'gemëscht Expressioun vun den dräi MYH-Isoformen op UMAP-Niveau evaluéiert gouf (Ergänzungsfiguren 4I-J). Sou kënnen, wärend 2X-Faseren eleng op Basis vun der MYH-Quantifizéierung um Transkriptniveau identifizéiert ginn, MYH1+-Faseren net vun anere schnelle Faseren ënnerscheet ginn, wann een dat ganzt Transkriptom oder Proteom betruecht.
Als éischt Untersuchung vun der Heterogenitéit vu luese Faseren iwwer MYH eraus, hu mir véier etabléiert lues Fasertypspezifesch Proteine ënnersicht: TPM3, TNNT1, MYL3 an ATP2A22. Lues Faser-Subtypen hunn héich, awer net perfekt, Pearson-Korrelatiounen mat MYH7 souwuel an der Transkriptomik (Ergänzungsfigur 5A) wéi och an der Proteomik (Ergänzungsfigur 5B) gewisen. Ongeféier 25% an 33% vun de luese Faseren goufen net als reng lues Faseren vun alle Gen/Protein-Subtypen an der Transkriptomik (Ergänzungsfigur 5C) respektiv der Proteomik (Ergänzungsfigur 5D) klasséiert. Dofir bréngt d'Klassifikatioun vu luese Faseren baséiert op verschiddene Gen/Protein-Subtypen zousätzlech Komplexitéit mat sech, och fir Proteinen, déi als fasertypspezifesch bekannt sinn. Dëst weist drop hin, datt d'Klassifikatioun vu Faseren baséiert op Isoformen vun enger eenzeger Gen/Protein-Famill déi richteg Heterogenitéit vu Skelettmuskelfaseren net adäquat reflektéiert.
Fir d'phenotypesch Variabilitéit vu mënschleche Skelettmuskelfaseren op der Skala vum ganze Omics-Modell weider z'ënnersichen, hu mir eng onparteiesch Dimensiounsreduktioun vun den Donnéeën mat Hëllef vun der Haaptkomponentenanalyse (PCA) duerchgefouert (Figur 2A). Ähnlech wéi bei den UMAP-Diagrammer hunn weder den Deelhueler nach den Testdag d'Faserclustering op PCA-Niveau beaflosst (Ergänzungsfiguren 6A-C). An zwou Datensätz gouf den MYH-baséierte Fasertyp duerch PC2 erkläert, deen e Cluster vu lues-zuckende Faseren vum Typ 1 an en zweete Cluster mat séier-zuckende Faseren vum Typ 2A, Typ 2X a gemëschte 2A/2X gewisen huet (Figur 2A). An zwou Datensätz waren dës zwee Cluster duerch eng kleng Zuel vu gemëschte Faseren vum Typ 1/2A verbonnen. Wéi erwaart huet d'Iwwerrepresentatiounsanalyse vun den Haapt-PC-Treiber bestätegt, datt PC2 duerch kontraktil a metabolesch Signaturen ugedriwwe gouf (Figur 2B an Ergänzungsfiguren 6D-E, Ergänzungsdatensätz 5-6). Insgesamt gouf festgestallt, datt den MYH-baséierte Fasertyp ausreechend ass, fir déi kontinuéierlech Variatioun laanscht PC2 z'erklären, mat Ausnam vun sougenannten 2X-Faseren, déi am ganze Transkriptom am schnelle Cluster verdeelt waren.
A. Principal Component Analysis (PCA) Diagrammer vun Transkriptom- a Proteom-Datensätz, déi no Fasertyp baséiert op MYH faarweg gemaach goufen. B. Anreicherungsanalyse vun Transkript- a Proteintreiber a PC2 a PC1. Statistesch Analyse gouf mat dem ClusterProfiler Package a Benjamini-Hochberg ugepassten p-Wäerter duerchgefouert. C, D. PCA-Diagrammer, déi no interzelluläre Adhäsiounsgenontologie (GO)-Termen am Transkriptom- a Kostamer-GO-Termen am Proteom faarweg gemaach goufen. Pfeiler representéieren Transkript- a Proteintreiber an hir Richtungen. E, F. Uniform Manifold Approximatiouns- a Projektiounsdiagrammer (UMAP) vu klinesch relevante Featuren, déi Expressiounsgradienten onofhängeg vum luesen/schnelle Fasertyp weisen. G, H. Korrelatiounen tëscht PC2- an PC1-Treiber an Transkriptomen a Proteomen.
Iwwerraschenderweis huet den MYH-baséierte Myofaser-Typ nëmmen den zweethéchste Grad vun der Variabilitéit (PC2) erkläert, wat drop hiweist, datt aner biologesch Faktoren, déi net mam MYH-baséierte Myofaser-Typ (PC1) zesummenhänken, eng wichteg Roll bei der Reguléierung vun der Heterogenitéit vun de Skelettmuskelfaseren spillen. Eng Iwwerrepresentatiounsanalyse vun den Haapttreiber am PC1 huet gewisen, datt d'Variabilitéit am PC1 haaptsächlech duerch Zell-Zell-Adhäsioun an de Ribosom-Gehalt am Transkriptom, souwéi duerch Kostameren a ribosomal Proteinen am Proteom bestëmmt gouf (Figur 2B an Ergänzungsfiguren 6D-E, Ergänzungsdatensatz 7). Am Skelettmuskel verbannen d'Kostameren d'Z-Disk mam Sarkolemma a si bedeelegt un der Kraafttransmissioun an der Signalgebung. 25 Annotéiert PCA-Plots mat Zell-Zell-Adhäsiouns- (Transkriptom, Figur 2C) a Kostameren- (Proteom, Figur 2D)-Charakteristiken hunn eng staark Lénksverrécklung am PC1 gewisen, wat drop hiweist, datt dës Charakteristiken a bestëmmte Faseren beräichert sinn.
Eng méi detailléiert Untersuchung vun der Myofaser-Clustering op UMAP-Niveau huet gewisen, datt déi meescht Charakteristiken e myofasertyp-onofhängege MYH-baséierten Expressiounsgradient weisen, anstatt e myofaser-Subcluster-spezifeschen. Dës Kontinuitéit gouf fir verschidde Genen observéiert, déi mat pathologesche Konditiounen assoziéiert sinn (Figur 2E), wéi CHCHD10 (neuromuskulär Krankheet), SLIT3 (Muskelatrophie), CTDNEP1 (Muskelkrankheet). Dës Kontinuitéit gouf och iwwer de ganze Proteom observéiert, dorënner Proteinen, déi mat neurologesche Stéierungen assoziéiert sinn (UGDH), Insulinsignalgebung (PHIP) an Transkriptioun (HIST1H2AB) (Figur 2F). Zesummegefaasst weisen dës Donnéeën eng Kontinuitéit an der fasertyp-onofhängeger lues/schnell-Zucker-Heterogenitéit iwwer verschidde Myofaser.
Interessanterweis hunn d'Drivergenen am PC2 eng gutt Transkriptom-Proteom-Korrelatioun gewisen (r = 0,663) (Figur 2G), wat drop hiweist, datt lues a séier Fasertypen, an insbesondere déi kontraktil an metabolesch Eegeschafte vu Skelettmuskelfaseren, transkriptionell reguléiert sinn. Wéi och ëmmer, d'Drivergenen am PC1 hunn keng Transkriptom-Proteom-Korrelatioun gewisen (r = -0,027) (Figur 2H), wat drop hiweist, datt Variatiounen, déi net mat lues/schnell Fasertypen zesummenhänken, gréisstendeels posttranskriptionell reguléiert ginn. Well d'Variatiounen am PC1 haaptsächlech duerch ribosomal Genontologie-Begrëffer erkläert goufen, a well Ribosomen eng entscheedend a spezialiséiert Roll an der Zell spillen, andeems se aktiv un der Proteintranslatioun deelhuelen an se beaflossen,31 hu mir eis als nächst dofir agesat, dës onerwaart ribosomal Heterogenitéit z'ënnersichen.
Mir hunn als éischt de Diagramm vun der Proteomik-Haaptkomponentanalyse no der relativer Heefegkeet vu Proteinen am GOCC-Term "zytoplasmatesche Ribosom" faarweg gemaach (Figur 3A). Obwuel dësen Term op der positiver Säit vum PC1 beräichert ass, wat zu engem klenge Gradient féiert, dreiwen ribosomal Proteinen d'Partitionéierung a béide Richtungen vum PC1 (Figur 3A). Ribosomal Proteinen, déi op der negativer Säit vum PC1 beräichert sinn, enthalen RPL18, RPS18 an RPS13 (Figur 3B), während RPL31, RPL35 an RPL38 (Figur 3C) déi Haapttreiber op der positiver Säit vum PC1 waren. Interessanterweis goufen RPL38 an RPS13 am Verglach mat anere Gewëss staark am Skelettmuskel expriméiert (Ergänzungsfigur 7A). Dës markant ribosomal Signaturen am PC1 goufen net am Transkriptom observéiert (Ergänzungsfigur 7B), wat op eng posttranskriptionell Reguléierung hiweist.
A. Principal Component Analysis (PCA) Diagram, faarweg no zytoplasmatesche ribosomale Genontologie (GO) Termen iwwer de Proteom. D'Pfeiler weisen d'Richtung vun der proteinvermittelter Variatioun am PCA Diagram un. D'Linnlängt entsprécht dem Principal Component Score fir e bestëmmte Protein. B, C. PCA Feature Diagrammer fir RPS13 an RPL38. D. Oniwwerwaacht hierarchesch Clustering Analyse vu zytoplasmatesche ribosomale Proteinen. E. Strukturmodell vum 80S Ribosom (PDB: 4V6X), deen ribosomal Proteinen mat ënnerschiddlecher Heefegkeet a Skelettmuskelfaseren ervirhiewt. F. Ribosomal Proteinen mat ënnerschiddlecher Stöchiometrie lokaliséiert beim mRNA-Ausgangskanal.
D'Konzepter vun der ribosomaler Heterogenitéit a Spezialiséierung goufen schonn virgeschloen, wouduerch d'Präsenz vun ënnerschiddleche Ribosom-Ënnerpopulatiounen (ribosomal Heterogenitéit) d'Proteintranslatioun a verschiddene Gewëss32 an Zellen33 direkt beaflosse kann duerch déi selektiv Translatioun vu spezifesche mRNA-Transkriptpools34 (Ribosom-Spezialiséierung). Fir Ënnerpopulatioune vu ribosomale Proteinen z'identifizéieren, déi a Skelettmuskelfaseren zesummegedréckt ginn, hu mir eng oniwwerwaacht hierarchesch Clusteringanalyse vu ribosomale Proteinen am Proteom duerchgefouert (Figur 3D, Ergänzungsdatensatz 8). Wéi erwaart, hunn sech ribosomal Proteinen net no Fasertyp baséiert op MYH geclustert. Mir hunn awer dräi ënnerschiddlech Cluster vu ribosomale Proteinen identifizéiert; den éischte Cluster (ribosomal_cluster_1) ass mat RPL38 koreguléiert an huet dofir eng erhéicht Expressioun a Faseren mat engem positiven PC1-Profil. Den zweete Cluster (ribosomal_cluster_2) ass mat RPS13 koreguléiert an ass a Faseren mat engem negativen PC1-Profil erhéicht. Den drëtte Cluster (ribosomal_cluster_3) weist keng koordinéiert differentiell Expressioun a Skelettmuskelfaseren a kann als dat "Kär"-Skelettmuskel-Ribosomprotein ugesi ginn. Béid Ribosomalcluster 1 an 2 enthalen ribosomal Proteinen, vun deenen virdru gewisen gouf, datt se alternativ Translatioun reguléieren (z.B. RPL10A, RPL38, RPS19 an RPS25) a funktionell d'Entwécklung beaflossen (z.B. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Am Aklang mat de PCA-Resultater huet déi observéiert heterogen Representatioun vun dëse ribosomale Proteinen iwwer d'Faseren och Kontinuitéit gewisen (Ergänzungsfigur 7C).
Fir d'Plazéierung vun heterogenen ribosomale Proteinen am Ribosom ze visualiséieren, hu mir e strukturellt Modell vum mënschleche 80S Ribosom benotzt (Protein Data Bank: 4V6X) (Figur 3E). Nodeems mir ribosomal Proteinen isoléiert hunn, déi zu verschiddene ribosomale Cluster gehéieren, waren hir Plazen net enk ausgeriicht, wat drop hiweist, datt eis Approche keng Anreicherung fir bestëmmte Regiounen/Fraktioune vum Ribosom geliwwert huet. Interessanterweis war awer den Undeel vu grousse Subeenheetproteinen am Cluster 2 méi niddreg wéi an de Cluster 1 an 3 (Ergänzungsfigur 7D). Mir hunn observéiert, datt Proteinen mat verännerter Stöchiometrie a Skelettmuskelfaseren haaptsächlech op der Ribosomuewerfläch lokaliséiert waren (Figur 3E), wat mat hirer Fäegkeet iwwereneestëmmt, mat internen Ribosom-Entrée-Plaz-Elementer (IRES) a verschiddene mRNA-Populatiounen ze interagéieren, an doduerch eng selektiv Translatioun ze koordinéieren. 40, 41 Ausserdeem ware vill Proteinen mat verännerter Stöchiometrie a Skelettmuskelfaseren no bei funktionelle Regiounen wéi dem mRNA-Ausgangstunnel lokaliséiert (Figur 3F), déi selektiv d'Translatiounsverlängerung an d'Arrest vu spezifesche Peptiden reguléieren. 42 Zesummefaassend suggeréieren eis Donnéeën, datt d'Stöchiometrie vun de Ribosomproteine vum Skelettmuskel Heterogenitéit weist, wat zu Ënnerscheeder tëscht de Skelettmuskelfaseren féiert.
Mir hunn eis als nächst virgeholl, séier a lues zuckend Fasersignaturen z'identifizéieren an d'Mechanismen vun hirer Transkriptiounsreguléierung z'ënnersichen. Beim Verglach vun de séieren a luesen Fasercluster, déi vun UMAP an den zwou Datensätz definéiert sinn (Figuren 1G–H an 4A–B), hunn transkriptomesch an proteomesch Analysen 1366 respektiv 804 ënnerschiddlech heefeg Charakteristiken identifizéiert (Figuren 4A–B, Ergänzungsdatensätz 9–12). Mir hunn déi erwaart Ënnerscheeder an de Signaturen am Zesummenhang mat Sarkomeren (z.B. Tropomyosin an Troponin), Excitatiouns-Kontraktiounskopplung (SERCA-Isoformen) an Energiemetabolismus (z.B. ALDOA a CKB) observéiert. Ausserdeem goufen Transkripten a Proteinen, déi d'Proteinubiquitinatioun reguléieren, ënnerschiddlech a séieren a luesen Faseren expriméiert (z.B. USP54, SH3RF2, USP28 an USP48) (Figuren 4A–B). Ausserdeem war de mikrobiellen Proteingen RP11-451G4.2 (DWORF), vun deem virdru gewisen gouf, datt en differenziell iwwer all Lämmchemuskelfasertypen43 expriméiert gëtt an d'SERCA-Aktivitéit am Häerzmuskel44 verbessert, a luese Skelettmuskelfaseren signifikant eropreguléiert gouf (Figur 4A). Ähnlech goufen op der Ebene vun den eenzelne Faseren signifikant Ënnerscheeder a bekannte Signaturen, wéi z. B. Metabolismus-bezogenen Laktatdehydrogenase-Isoformen (LDHA an LDHB, Figur 4C an Ergänzungsfigur 8A)45,46 souwéi virdrun onbekannte fasertypspezifesche Signaturen (wéi IRX3, USP54, USP28 an DPYSL3) observéiert (Figur 4C). Et gouf eng signifikant Iwwerlappung vun differenziell expriméierten Eegeschafte tëscht den transkriptomeschen an proteomeschen Datensätz festgestallt (Ergänzungsfigur 8B), souwéi eng Korrelatioun vun der Foldännerung, déi haaptsächlech duerch déi méi ausgeprägt differenziell Expressioun vu Sarkomerfeatures gedriwwe gëtt (Ergänzungsfigur 8C). Bemerkenswäert ass, datt verschidde Signaturen (z.B. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) eng staark posttranskriptionell Reguléierung nëmmen op proteomeschem Niveau gewisen hunn an lues/schnell Twitch-Fasertypspezifesch Expressiounsprofiler haten (Ergänzungsfigur 8C).
A an B Vulkandiagrammer, déi lues a séier Cluster vergläichen, déi duerch d'Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) Diagrammer an de Figuren 1G-H identifizéiert goufen. Faarweg Punkten representéieren Transkripten oder Proteinen, déi sech signifikant bei FDR < 0,05 ënnerscheeden, an donkel Punkten representéieren Transkripten oder Proteinen, déi sech signifikant bei Log Change > 1 ënnerscheeden. Eng bilateral statistesch Analyse gouf mat dem DESeq2 Wald Test mat Benjamini-Hochberg ugepassten p-Wäerter (Transkriptomik) oder der Limma linearer Modellmethod mat empirescher Bayesianer Analyse gefollegt vun enger Benjamini-Hochberg Upassung fir multiple Vergläicher (Proteomik) duerchgefouert. C Signaturdiagrammer vun ausgewählten differentiell expriméierte Genen oder Proteinen tëscht luesen a schnelle Faseren. D Anreicherungsanalyse vu signifikant differentiell expriméierten Transkripten a Proteinen. Iwwerlappend Wäerter sinn an deenen zwou Datensätz beräichert, Transkriptomwäerter sinn nëmmen am Transkriptom beräichert, a Proteomwäerter sinn nëmmen am Proteom beräichert. Déi statistesch Analyse gouf mat dem ClusterProfiler Package mat Benjamini-Hochberg ugepassten p-Wäerter duerchgefouert. E. Fasertypspezifesch Transkriptiounsfaktoren, déi vum SCENIC identifizéiert goufen, baséiert op SCENIC-ofgeleeten Reguléiererspezifizitéitsscores an differentieller mRNA-Expressioun tëscht Fasertypen. F. Profiléierung vun ausgewählten Transkriptiounsfaktoren, déi differentiell tëscht luesen a schnelle Faseren expriméiert ginn.
Mir hunn duerno eng Iwwerrepresentatiounsanalyse vun ënnerschiddlech representéierte Genen a Proteinen duerchgefouert (Figur 4D, Ergänzungsdatensatz 13). D'Beräicherung vum Zellwee fir Charakteristiken, déi sech tëscht den zwou Datensätz ënnerscheeden, huet erwaart Ënnerscheeder opgedeckt, wéi z. B. Fettsäure-β-Oxidatioun a Ketonmetabolismusprozesser (lues Faseren), Myofilament-/Muskelkontraktioun (séier a lues Faseren) a Kuelenhydratkatabolesch Prozesser (séier Faseren). D'Serin-/Threonin-Proteinphosphataseaktivitéit war och a schnelle Faseren erhéicht, ugedriwwe vu Charakteristiken wéi déi regulatoresch a katalytesch Phosphatase-Ënnereenheeten (PPP3CB, PPP1R3D a PPP1R3A), déi bekannt sinn, de Glykogenmetabolismus ze reguléieren (47) (Ergänzungsfiguren 8D-E). Aner Weeër, déi mat schnelle Faseren beräichert goufen, waren ënner anerem Veraarbechtungs- (P-) Kierper (YTHDF3, TRIM21, LSM2) am Proteom (Ergänzungsfigur 8F), déi potenziell un der posttranskriptioneller Reguléierung (48) bedeelegt sinn, an Transkriptiounsfaktoraktivitéit (SREBF1, RXRG, RORA) am Transkriptom (Ergänzungsfigur 8G). Lues Fasere goufen mat Oxidoreduktaseaktivitéit (BDH1, DCXR, TXN2) beräichert (Ergänzungsfigur 8H), Amidbindung (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Ergänzungsfigur 8I), extrazellulärer Matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Ergänzungsfigur 8J) an Rezeptor-Ligandaktivitéit (FNDC5, SPX, NENF) (Ergänzungsfigur 8K).
Fir weider Abléck an d'Transkriptiounsreguléierung ze kréien, déi de Charakteristike vun der lueser/schneller Muskelfaser zugrond läit, hu mir eng Analyse vun den Transkriptiounsfaktoren mat Hëllef vun SCENIC49 (Supplementary Data Set 14) duerchgefouert. Vill Transkriptiounsfaktoren ware signifikant tëscht schnelle a luese Muskelfaseren beräichert (Figur 4E). Dozou gehéieren Transkriptiounsfaktoren wéi MAFA, wat virdru mat enger schneller Muskelfaserentwécklung a Verbindung bruecht gouf,50, souwéi verschidde Transkriptiounsfaktoren, déi virdru net mat Muskelfasertyp-spezifesche Genprogrammer assoziéiert goufen. Dorënner waren PITX1, EGR1 a MYF6 déi am meeschten beräichert Transkriptiounsfaktoren a schnelle Muskelfaseren (Figur 4E). Am Géigesaz dozou waren ZSCAN30 an EPAS1 (och bekannt als HIF2A) déi am meeschten beräichert Transkriptiounsfaktoren a luese Muskelfaseren (Figur 4E). Am Aklang domat gouf MAFA a méi héijen Niveauen an der UMAP-Regioun expriméiert, déi de schnelle Muskelfaseren entsprécht, während EPAS1 dat entgéintgesate Expressiounsmuster hat (Figur 4F).
Nieft bekannte protein-codéierende Genen gëtt et vill net-codéierend RNA-Biotypen, déi un der Reguléierung vun der mënschlecher Entwécklung a Krankheeten bedeelegt kënne sinn. 51, 52 An Transkriptom-Datensätz weisen e puer net-codéierend RNAen eng Fasertypspezifizitéit op (Figur 5A an Ergänzungsdatensaz 15), dorënner LINC01405, wat héich spezifesch fir lues Faseren ass a bericht gëtt, datt et am Muskel vu Patienten mat mitochondrialer Myopathie reduzéiert ass. 53 Am Géigesaz dozou weist RP11-255P5.3, deen dem lnc-ERCC5-5-5-Gen entsprécht (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, eng séier Fasertypspezifizitéit op. Souwuel LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) wéi och RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) weisen Skelettmuskelspezifizitéit op (Ergänzungsfiguren 9A-B) a keng bekannt kontraktil Genen an hirem 1 Mb genomesche Quartier, wat drop hiweist, datt si eng spezialiséiert Roll bei der Reguléierung vu Fasertypen spillen anstatt bei der Reguléierung vun den Nopeschkontraktilgenen. Déi lues/schnell fasertypspezifesch Expressiounsprofile vu LINC01405 respektiv RP11-255P5.3 goufen mat RNAscope bestätegt (Figuren 5B-C).
A. Net-kodéierend RNA-Transkripte gi wesentlech a lues a séier zuckende Muskelfaseren reguléiert. B. Representativ RNAscope-Biller, déi d'Spezifizitéit vun de luesen a séieren Faserentyp vun LINC01405 respektiv RP11-255P5.3 weisen. Skala-Balk = 50 μm. C. Quantifizéierung vun der myofasertypspezifescher net-kodéierender RNA-Expressioun, bestëmmt vum RNAscope (n = 3 Biopsien vun onofhängege Persounen, déi séier a lues Muskelfaseren an all Persoun vergläichen). Statistesch Analyse gouf mat engem zweesäitege Student's t-Test duerchgefouert. Boxdiagrammer weisen de Median an den éischten an drëtte Quartil, mat Whiskers, déi op déi minimal a maximal Wäerter weisen. D. De novo mikrobiellen Proteinidentifikatiounsworkflow (erstellt mat BioRender.com). E. De mikrobiellen Protein LINC01405_ORF408:17441:17358 gëtt spezifesch a luesen Skelettmuskelfaseren expriméiert (n=5 Biopsien vun onofhängege Participanten, déi séier a lues Muskelfaseren an all Participant vergläichen). D'statistesch Analyse gouf mat der Limm-linearer Modellmethod a Kombinatioun mat engem empiresche Bayesianeschen Usaz duerchgefouert, gefollegt vun der Benjamini-Hochberg-Method fir multiple Vergläicher mat p-Wäert-Upassung. Boxdiagrammer weisen de Median, den éischten an den drëtte Quartil, mat Whiskers, déi op déi maximal/minimal Wäerter weisen.
Rezent hunn Studien gewisen, datt vill vermutlech net-kodéierend Transkripten transkribéiert mikrobiell Proteinen kodéieren, vun deenen e puer d'Muskelfunktioun reguléieren. 44, 55 Fir mikrobiell Proteinen mat potenzieller Fasertypspezifizitéit z'identifizéieren, hu mir eisen 1000-Faser-Proteom-Datasaz mat enger personaliséierter FASTA-Datei duerchsicht, déi d'Sequenzen vun net-kodéierenden Transkripten (n = 305) enthält, déi am 1000-Faser-Transkriptom-Datasaz fonnt goufen (Figur 5D). Mir hunn 197 mikrobiell Proteinen aus 22 verschiddenen Transkripten identifizéiert, vun deenen 71 differenziell tëscht luesen a schnelle Skelettmuskelfaseren reguléiert goufen (Ergänzungsfigur 9C an Ergänzungsdatensatz 16). Fir LINC01405 goufen dräi mikrobiell Proteinprodukter identifizéiert, vun deenen ee eng ähnlech lues Faserspezifizitéit wéi säin Transkript gewisen huet (Figur 5E an Ergänzungsfigur 9D). Dofir hu mir LINC01405 als e Gen identifizéiert, dat e mikrobiellt Protein kodéiert, dat spezifesch fir lues Skelettmuskelfaseren ass.
Mir hunn e komplette Workflow fir eng grouss proteomesch Charakteriséierung vun eenzelne Muskelfaseren entwéckelt an d'Reguléierer vun der Faserheterogenitéit a gesonde Staaten identifizéiert. Mir hunn dëse Workflow ugewannt fir ze verstoen, wéi Nemalin-Myopathien d'Heterogenitéit vun de Skelettmuskelfaseren beaflossen. Nemalin-Myopathien sinn ierflech Muskelkrankheeten, déi Muskelschwäche verursaachen a bei betraffene Kanner eng Rei vu Komplikatioune weisen, dorënner Atmungsschwieregkeeten, Skoliose a limitéierter Gliedmaassmobilitéit.19,20 Typesch féieren bei Nemalin-Myopathien pathogen Varianten a Genen wéi Aktin Alpha 1 (ACTA1) zu enger Iwwerleeënheet vun der lues zuckender Faser-Myofaser-Zesummesetzung, obwuel dësen Effekt heterogen ass. Eng bemierkenswäert Ausnam ass d'Troponin T1 Nemalin-Myopathie (TNNT1), déi eng Iwwerleeënheet vu schnelle Faseren huet. Dofir kann e besser Verständnis vun der Heterogenitéit, déi der Dysreguléierung vun de Skelettmuskelfaseren zugronn läit, déi bei Nemalin-Myopathien observéiert gëtt, hëllefen, déi komplex Bezéiung tëscht dëse Krankheeten an dem Myofasertyp ze léisen.
Am Verglach mat gesonde Kontrollpersounen (n=3 pro Grupp) hunn d'Myofasern, déi vu Patienten mat Nemalin-Myopathie mat Mutatiounen an den ACTA1- an TNNT1-Genen isoléiert goufen, eng markant Myofaseratrophie oder -dystrophie gewisen (Figur 6A, Ergänzungstabell 3). Dëst huet bedeitend technesch Erausfuerderunge fir d'Proteomanalyse mat sech bruecht, well d'Material limitéiert war. Trotzdeem konnten mir 2485 Proteinen an 272 Skelett-Myofasern detektéieren. Nodeems mir op d'mannst 1000 quantifizéiert Proteinen pro Faser gefiltert haten, goufen 250 Faseren enger spéiderer bioinformatescher Analyse ënnerworf. Nom Filteren goufen am Duerchschnëtt 1573 ± 359 Proteinen pro Faser quantifizéiert (Ergänzungsfigur 10A, Ergänzungsdaten 17–18). Bemierkenswäert ass, datt d'Proteomdéift vun de Prouwe vu Patienten mat Nemalin-Myopathie nëmme liicht reduzéiert gouf, trotz der bedeitender Reduktioun vun der Fasergréisst. Ausserdeem huet d'Veraarbechtung vun dësen Donnéeën mat eisen eegenen FASTA-Dateien (inklusiv net-codéierend Transkripten) et eis erméiglecht, fënnef mikrobiell Proteinen a Skelett-Myofaseren vu Patienten mat Nemaline-Myopathie z'identifizéieren (Ergänzungsdatensatz 19). Den dynamesche Beräich vum Proteom war däitlech méi breet, an d'Gesamtproteine vun der Kontrollgrupp hunn gutt mat de Resultater vun enger fréierer Proteomanalyse mat 1000 Faseren korreléiert (Ergänzungsfigur 10B-C).
A. Mikroskopesch Biller, déi Faseratrophie oder -dystrophie an d'Iwwerhand vun ënnerschiddlechen Fasertypen baséiert op MYH bei ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien (NM) weisen. Skala = 100 μm. Fir d'Reproduzéierbarkeet vun der Färbung bei ACTA1- an TNNT1-Patienten ze garantéieren, goufen dräi Patientebiopsien zwee bis dräimol gefierft (véier Sektiounen pro Fall), ier representativ Biller ausgewielt goufen. B. Fasertypproportiounen bei de Participanten baséiert op MYH. C. Haaptkomponentenanalyse (PCA-Diagramm) vu Skelettmuskelfaseren bei Patienten mat Nemaline-Myopathien a Kontrollen. D. Skelettmuskelfaseren vu Patienten mat Nemaline-Myopathien a Kontrollen, déi op e PCA-Diagramm projetéiert ginn, deen aus den 1000 Faseren bestëmmt gouf, déi an der Figur 2 analyséiert goufen. Zum Beispill Vulkandiagrammer, déi Ënnerscheeder tëscht Participanten mat ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien a Kontrollen, a tëscht Participanten mat ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien, vergläichen. Faarweg Kreesser bezeechnen Proteinen, déi bei π < 0,05 signifikant ënnerschiddlech waren, an donkel Punkten bezeechnen Proteinen, déi bei FDR < 0,05 signifikant ënnerschiddlech waren. D'statistesch Analyse gouf mat der Limma linearer Modellmethod an empiresche Bayesianesche Methoden duerchgefouert, gefollegt vun enger p-Wäert-Upassung fir multiple Vergläicher mat der Benjamini-Hochberg Method. H. Anreicherungsanalyse vu signifikant differenziell expriméierte Proteinen iwwer dat ganzt Proteom an an Typ 1 an 2A Faseren. D'statistesch Analyse gouf mat dem ClusterProfiler Package a Benjamini-Hochberg ugepassten p-Wäerter duerchgefouert. I, J. Haaptkomponentenanalyse (PCA) Diagrammer, déi no extrazellulärer Matrix an mitochondrial Genontologie (GO) Termer gefierft sinn.
Well Nemalin-Myopathien den Undeel vun MYH-expriméierenden Myofasertypen am Skelettmuskel beaflosse kënnen,19,20 hu mir fir d'éischt déi MYH-expriméierend Myofasertypen bei Patienten mat Nemalin-Myopathien a Kontrollgruppen ënnersicht. Mir hunn de Myofasertyp mat enger onparteiescher Method bestëmmt, déi virdru fir den 1000-Myofaser-Assay beschriwwe gouf (Ergänzungsfiguren 10D-E), an et ass eis erëm net gelongen, reng 2X-Myofaser z'identifizéieren (Figur 6B). Mir hunn en heterogenen Effekt vun Nemalin-Myopathien op den Myofasertyp observéiert, well zwee Patienten mat ACTA1-Mutatiounen en erhéichten Undeel vun Typ-1-Myofasern haten, während zwee Patienten mat TNNT1-Nemalin-Myopathie en erofgesaten Undeel vun Typ-1-Myofasern haten (Figur 6B). Tatsächlech war d'Expressioun vu MYH2 a schnelle Troponin-Isoformen (TNNC2, TNNI2 an TNNT3) bei ACTA1-Nemaline Myopathien erofgaangen, während d'MYH7-Expressioun bei TNNT1-Nemaline Myopathien erofgaangen ass (Ergänzungsfigur 11A). Dëst entsprécht fréiere Berichter iwwer heterogen Myofaser-Typwiessel bei Nemaline Myopathien.19,20 Mir hunn dës Resultater duerch Immunhistochemie bestätegt a festgestallt, datt Patienten mat ACTA1-Nemaline Myopathie eng Iwwerleeënheet vun Typ 1 Myofaseren haten, während Patienten mat TNNT1-Nemaline Myopathie dat Géigendeelmuster haten (Figur 6A).
Um Niveau vun den eenzelne Faseren hunn sech d'Skelettmuskelfasere vu Patienten mat ACTA1- an TNNT1-Nemalin-Myopathie mat der Majoritéit vun de Kontrollfasere zesummegedoen, woubäi d'TNNT1-Nemalin-Myopathiefasere generell am stäerksten betraff waren (Figur 6C). Dëst war besonnesch evident beim Opstellung vun Haaptkomponentenanalyse (PCA)-Plots vu pseudo-opgeblosene Fasere fir all Patient, woubäi d'Patienten 2 an 3 mat TNNT1-Nemalin-Myopathie am wäitsten vun de Kontrollprouwen ewech waren (Ergänzungsfigur 11B, Ergänzungsdatensatz 20). Fir besser ze verstoen, wéi d'Fasere vu Myopathiepatienten am Verglach mat gesonde Fasere sinn, hu mir detailléiert Informatiounen aus der proteomescher Analyse vun 1.000 Fasere vu gesonde erwuessene Participanten benotzt. Mir hunn d'Fasere vum Myopathie-Datesaz (ACTA1- an TNNT1-Nemalin-Myopathiepatienten a Kontrollen) op de PCA-Plot projetéiert, deen aus der proteomescher Analyse vun 1000 Fasere kritt gouf (Figur 6D). D'Verdeelung vun den MYH-Fasertypen laanscht PC2 an de Kontrollfaseren war ähnlech wéi d'Faserverdeelung, déi aus der 1000-Faseren-Proteomik-Analyse kritt gouf. Wéi och ëmmer, déi meescht Faseren bei Patienten mat Nemaline-Myopathie hunn sech PC2 no ënnen verréckelt, a sech mat gesonde séier-zuckende Faseren iwwerlappt, onofhängeg vun hirem nativen MYH-Fasertyp. Dofir, obwuel Patienten mat ACTA1-Nemaline-Myopathie eng Verrécklung a Richtung Typ-1-Faseren gewisen hunn, wa se mat MYH-baséierte Methoden quantifizéiert goufen, hunn souwuel d'ACTA1-Nemaline-Myopathie wéi och d'TNNT1-Nemaline-Myopathie de Skelettmuskelfaserproteom a Richtung séier-zuckende Faseren verréckelt.
Mir hunn dann all Patientengrupp direkt mat gesonde Kontrollpersounen verglach an 256 respektiv 552 differenziell expriméiert Proteinen an den ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien identifizéiert (Figur 6E–G an Ergänzungsfigur 11C, Ergänzungsdatensatz 21). D'Genberäicherungsanalyse huet eng koordinéiert Ofsenkung vun de mitochondrialen Proteinen opgedeckt (Figur 6H–I, Ergänzungsdatensatz 22). Iwwerraschenderweis war dës Ofsenkung, trotz der differenzieller Iwwerleeënheet vun de Fasertypen an den ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien, komplett onofhängeg vum MYH-baséierte Fasertyp (Figur 6H an Ergänzungsfiguren 11D–I, Ergänzungsdatensatz 23). Dräi mikrobiell Proteine goufen och an den ACTA1- oder TNNT1-Nemaline-Myopathien reguléiert. Zwee vun dëse Mikroproteinen, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (och bekannt als LINC00598 oder Lnc-FOXO1) an ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), hunn nëmmen an Typ 1 Myofaseren eng ënnerschiddlech Heefegkeet gewisen. Et gouf virdru bericht, datt ENSG00000215483_TR14_ORF67 eng Roll an der Zellzyklusreguléierung spillt.56 Op der anerer Säit war ENSG00000232046_TR1_ORF437 (entsprécht LINC01798) souwuel an Typ 1 wéi och an Typ 2A Myofaseren an der ACTA1-Nemaline-Myopathie am Verglach mat gesonde Kontrollpersounen erhéicht (Ergänzungsfigur 12A, Ergänzungsdatensatz 24). Am Géigesaz dozou ware ribosomal Proteine gréisstendeels net vun der Nemalinmyopathie beaflosst, obwuel RPS17 an der ACTA1-Nemalinmyopathie erofreguléiert war (Fig. 6E).
D'Anreicherungsanalyse huet och eng Opreguléierung vun Immunsystemprozesser an ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien opgedeckt, während d'Zellhaftung och an der TNNT1-Nemaline-Myopathie erhéicht war (Figur 6H). D'Anreicherung vun dësen extrazelluläre Faktoren gouf duerch d'extrazellulär Matrixproteinen reflektéiert, déi PCA a PC1 a PC2 an eng negativ Richtung verréckelt hunn (d.h. a Richtung vun de betraffene Faseren) (Figur 6J). Béid Patientegruppen hunn eng erhéicht Expressioun vun extrazelluläre Proteinen gewisen, déi an Immunantworten a sarkolemmale Reparaturmechanismen involvéiert sinn, wéi z. B. Annexine (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 an hiert interagéierend Protein S100A1159 (Ergänzungsfiguren 12B-C). Dëse Prozess gouf virdru gemellt als verstäerkt bei Muskeldystrophien60, awer, souwäit mir wëssen, gouf en net virdru mat nemaline Myopathien a Verbindung bruecht. Déi normal Funktioun vun dëser molekularer Maschinn ass fir d'Sarkolemmale Reparatur no enger Verletzung an fir d'Fusioun vun nei geformte Myozyten mat Myofaseren58,61 noutwendeg. Dofir weist déi erhéicht Aktivitéit vun dësem Prozess a béide Patientengruppen op eng reparativ Reaktioun op eng Verletzung hin, déi duerch Myofaserinstabilitéit verursaacht gëtt.
D'Effekter vun all Nemalin-Myopathie ware gutt korreléiert (r = 0,736) a weisen eng raisonnabel Iwwerlappung (Ergänzungsfiguren 11A-B), wat drop hiweist, datt ACTA1 an TNNT1 Nemalin-Myopathie ähnlech Effekter op de Proteom hunn. Wéi och ëmmer, e puer Proteine goufen nëmmen an der ACTA1 oder TNNT1 Nemalin-Myopathie reguléiert (Ergänzungsfiguren 11A an C). Dat profibrotescht Protein MFAP4 war ee vun den am meeschten eropreguléierte Proteinen an der TNNT1 Nemalin-Myopathie, ass awer onverännert an der ACTA1 Nemalin-Myopathie bliwwen. SKIC8, eng Komponent vum PAF1C-Komplex, déi fir d'Reguléierung vun der HOX-Gentranskriptioun verantwortlech ass, war an der TNNT1 Nemalin-Myopathie erofreguléiert, awer net an der ACTA1 Nemalin-Myopathie beaflosst (Ergänzungsfigur 11A). En direkten Verglach vun der ACTA1- an der TNNT1-Nemalin-Myopathie huet méi grouss Reduktiounen vun de mitochondrialen Proteinen an eng Erhéijung vun den Immunsystemproteinen bei der TNNT1-Nemalin-Myopathie gewisen (Figur 6G–H an Ergänzungsfiguren 11C an 11H–I). Dës Donnéeën entspriechen der méi grousser Atrophie/Dystrophie, déi bei der TNNT1-Nemalin-Myopathie am Verglach mat der TNNT1-Nemalin-Myopathie observéiert gouf (Figur 6A), wat drop hiweist, datt d'TNNT1-Nemalin-Myopathie eng méi schwéier Form vun der Krankheet duerstellt.
Fir ze bewäerten, ob déi observéiert Effekter vun der Nemalin-Myopathie um ganze Muskelniveau bestoe bleiwen, hu mir eng Bulk-Proteomik-Analyse vu Muskelbiopsien aus der selwechter Kohort vu Patienten mat TNNT1-Nemalin-Myopathie duerchgefouert a si mat Kontrollgruppen verglach (n=3 pro Grupp) (Ergänzungsfigur 13A, Ergänzungsdatensatz 25). Wéi erwaart, waren d'Kontrollen an der Haaptkomponentenanalyse enk matenee verbonnen, während d'Patienten mat TNNT1-Nemalin-Myopathie eng méi héich Intersample-Variabilitéit gewisen hunn, ähnlech wéi déi an der Eenzelfaseranalyse (Ergänzungsfigur 13B). D'Bulk-Analyse huet déi differenziell expriméiert Proteinen (Ergänzungsfigur 13C, Ergänzungsdatensatz 26) a biologesch Prozesser (Ergänzungsfigur 13D, Ergänzungsdatensatz 27) reproduzéiert, déi duerch de Verglach vun eenzelne Faseren ervirgehuewe goufen, awer d'Fäegkeet verluer, tëscht verschiddene Fasertypen z'ënnerscheeden, a konnt heterogen Krankheetseffekter iwwer d'Faseren net berücksichtegen.
Zesummegeholl weisen dës Donnéeën, datt d'Proteomik vun eenzelne Myofasern klinesch biologesch Charakteristike ka klären, déi net duerch gezielt Methoden ewéi Immunoblotting nogewise kënne ginn. Ausserdeem ënnersträichen dës Donnéeën d'Limiten vun der Notzung vum Aktinfasertyping (MYH) eleng fir d'Beschreiwung vun der phenotypescher Adaptatioun. Tatsächlech, obwuel de Fasertypwiessel tëscht Aktin- an Troponin-Nemalin-Myopathien ënnerscheet, entkoppelen béid Nemalin-Myopathien d'MYH-Fasertyping vum Skelettmuskelfasermetabolismus a Richtung vun engem méi schnelle a manner oxidativen Muskelproteom.
Zellulär Heterogenitéit ass entscheedend fir datt d'Gewebe hir divers Ufuerderungen erfëlle kënnen. Am Skelettmuskel gëtt dëst dacks als Faserentypen beschriwwen, déi duerch ënnerschiddlech Grad u Kraaftproduktioun a Middegkeet charakteriséiert sinn. Et ass awer kloer, datt dëst nëmmen en klengen Deel vun der Variabilitéit vun de Skelettmuskelfaseren erkläert, déi vill méi variabel, komplex a villfälteg ass wéi virdru geduecht. Technologesch Fortschrëtter hunn elo Liicht op d'Faktoren bruecht, déi Skelettmuskelfaseren reguléieren. Tatsächlech suggeréieren eis Donnéeën, datt Typ 2X Faseren net onbedéngt en eegene Skelettmuskelfaser-Subtyp sinn. Ausserdeem hu mir metabolesch Proteinen, ribosomal Proteinen a zellassoziéiert Proteinen als wichteg Determinanten vun der Heterogenitéit vun de Skelettmuskelfaseren identifizéiert. Indem mir eise proteomesche Workflow op Patienteprouwen mat Nematodenmyopathie uwenden, hu mir weider demonstréiert, datt MYH-baséiert Faserentypéierung d'Skelettmuskelheterogenitéit net vollstänneg reflektéiert, besonnesch wann de System gestéiert ass. Tatsächlech, onofhängeg vum MYH-baséierte Faserentyp, féiert d'Nematodenmyopathie zu engem Verschiebung a Richtung méi séier a manner oxidativ Faseren.
Skelettmuskelfasere ginn zënter dem 19. Joerhonnert klasséiert. Rezent Omics-Analysen hunn et eis erméiglecht, d'Expressiounsprofiler vun ënnerschiddlechen MYH-Fasertypen an hir Reaktiounen op verschidde Stimuli ze verstoen. Wéi hei beschriwwen, hunn Omics-Approchen och de Virdeel vun enger méi grousser Sensibilitéit fir d'Quantifizéierung vu Fasertypmarkéierer wéi traditionell Antikörper-baséiert Methoden, ouni sech op d'Quantifizéierung vun engem eenzegen (oder e puer) Markéierer ze verloossen, fir en Skelettmuskelfasertyp ze definéieren. Mir hunn komplementär transkriptomesch a proteomesch Workflows benotzt an d'Resultater integréiert, fir d'transkriptionell a posttranskriptionell Reguléierung vun der Faserheterogenitéit a mënschleche Skelettmuskelfaseren z'ënnersichen. Dëse Workflow huet dozou gefouert, datt reng 2X-Typ Faseren um Proteinniveau am Vastus lateralis vun eiser Kohort vu gesonde jonke Männer net identifizéiert konnte ginn. Dëst entsprécht fréiere Studien iwwer eenzel Faseren, déi <1% reng 2X Faseren am gesonde Vastus lateralis fonnt hunn, obwuel dëst an Zukunft an anere Muskelen bestätegt soll ginn. D'Diskrepanz tëscht der Detektioun vu bal rengen 2X Faseren um mRNA-Niveau an nëmme gemëschte 2A/2X Faseren um Proteinniveau ass verwonnerlech. D'mRNA-Expressioun vum MYH-Isoform ass net zirkadian,67 wat drop hiweist, datt mir onwahrscheinlech den Ufankssignal vum MYH2 a scheinbar rengen 2X-Faseren op RNA-Niveau "verpasst" hunn. Eng méiglech Erklärung, obwuel reng hypothetesch, kéinte Ënnerscheeder an der Protein- an/oder mRNA-Stabilitéit tëscht MYH-Isoformen sinn. Tatsächlech ass keng séier Faser 100% reng fir iergendeng MYH-Isoform, an et ass net kloer, ob d'mRNA-Expressiounsniveauen vum MYH1 am Beräich vun 70-90% zu enger gläicher MYH1- an MYH2-Heefegkeet op Proteinniveau féiere géifen. Wann een awer dat ganzt Transkriptom oder Proteom berécksiichtegt, kann d'Clusteranalyse sécher nëmmen zwou verschidde Cluster identifizéieren, déi lues a séier Skelettmuskelfaseren representéieren, onofhängeg vun hirer präziser MYH-Zesummesetzung. Dëst entsprécht Analysen, déi Single-Nucleus-Transkriptomik-Approchen benotzen, déi typescherweis nëmmen zwou verschidde myonuklear Cluster identifizéieren. 68, 69, 70 Ausserdeem, obwuel fréier proteomesch Studien Typ 2X Faseren identifizéiert hunn, gruppéiere sech dës Faseren net getrennt vum Rescht vun de schnelle Faseren a weisen nëmmen eng kleng Zuel vun ënnerschiddlech reichleche Proteinen am Verglach mat anere Fasertypen baséiert op MYH. 14 Dës Resultater suggeréieren, datt mir op d'Siicht vun der Klassifikatioun vu Muskelfaseren aus dem fréien 20. Joerhonnert zréckgräife sollten, déi mënschlech Skelettmuskelfaseren net an dräi verschidde Klassen baséiert op MYH opgedeelt huet, mä an zwee Cluster baséiert op hire metaboleschen a kontraktile Eegeschaften. 63
Méi wichteg ass, datt d'Heterogenitéit vun de Myofaseren a verschiddene Dimensiounen berécksiichtegt soll ginn. Fréier "Omik"-Studien hunn an dës Richtung gewisen a suggeréiert, datt Skelettmuskelfaseren keng diskret Cluster bilden, mä laanscht e Kontinuum arrangéiert sinn.11, 13, 14, 64, 71 Hei weisen mir, datt, zousätzlech zu Ënnerscheeder an de kontraktilen an de metaboleschen Eegeschafte vum Skelettmuskel, Myofaseren duerch Charakteristiken am Zesummenhang mat Zell-Zell-Interaktiounen an Translatiounsmechanismen ënnerscheet kënne ginn. Tatsächlech hu mir Ribosomheterogenitéit a Skelettmuskelfaseren fonnt, déi zu Heterogenitéit bäidréit, onofhängeg vu luesen a schnelle Fasertypen. Déi ënnergräifend Ursaach vun dëser substantieller Myofaserenheterogenitéit, onofhängeg vum luesen a schnelle Fasertyp, bleift onkloer, awer si kéint op eng spezialiséiert raimlech Organisatioun bannent Muskelfaser hiweisen, déi optimal op spezifesch Kräften a Belaaschtungen reagéieren,72 spezialiséiert zellulär oder organspezifesch Kommunikatioun mat aneren Zelltypen am Muskelmikroumfeld73,74,75 oder Ënnerscheeder an der Ribosomaktivitéit bannent eenzelne Myofaseren hiweisen. Tatsächlech gouf gewisen, datt ribosomal Heteroplasmie, entweder duerch paralog Substitutioun vun RPL3 an RPL3L oder um Niveau vun der 2'O-Methylierung vun rRNA, mat Skelettmuskelhypertrophie assoziéiert ass76,77. Multiomesch a raimlech Uwendungen a Kombinatioun mat der funktioneller Charakteriséierung vun eenzelne Myofaser wäerten eist Verständnis vun der Muskelbiologie um multiomesche Niveau weider verbesseren78.
Indem mir d'Proteome vun eenzelne Myofaseren vu Patienten mat Nemaline-Myopathien analyséiert hunn, hu mir och den Notzen, d'Effektivitéit an d'Uwendbarkeet vun der Proteomik vun eenzelne Myofaseren demonstréiert, fir d'klinesch Pathophysiologie vum Skelettmuskel ze verstoen. Ausserdeem konnten mir, andeems mir eise Workflow mat der globaler Proteomikanalyse verglach hunn, noweisen, datt d'Proteomik vun eenzelne Myofaseren déiselwecht Informatiounsdéift liwwert wéi déi global Tissueproteomik an dës Déift erweidert, andeems se d'Interfaserheterogenitéit an den Myofaserentyp berécksiichtegt. Zousätzlech zu den erwaarten (wann och variabelen) Ënnerscheeder am Fasertypverhältnis, déi bei ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien am Verglach mat gesonde Kontrollpersounen observéiert goufen,19 hu mir och oxidativ an extrazellulär Remodeling onofhängeg vum MYH-vermittelten Fasertypwiessel observéiert. Fibrose gouf schonn a fréiere Fäll vu TNNT1-Nemaline-Myopathien gemellt.19 Eis Analyse baut awer op dësem Befund op, andeems se och erhéicht Niveauen vun extrazelluläre sekretéierte stressbezogenen Proteinen, wéi Annexinen, déi u sarkolemmale Reparaturmechanismen involvéiert sinn, a Myofaseren vu Patienten mat ACTA1- an TNNT1-Nemaline-Myopathien opdeckt.57,58,59 Zesummefaassend kéinten erhéicht Annexinniveauen a Myofaseren vu Patienten mat Nemaline-Myopathie eng zellulär Äntwert op d'Reparatur vu schwéier atrophesche Myofaseren duerstellen.
Obwuel dës Studie déi gréisst Analyse vun der Eenzelfaser-Ganz-Muskel-Omiks-Analyse vu Mënschen bis elo duerstellt, ass se net ouni Aschränkungen. Mir hunn Skelettmuskelfaseren aus enger relativ klenger an homogener Prouf vu Participanten an engem eenzege Muskel (de Vastus lateralis) isoléiert. Dofir ass et onméiglech, d'Existenz vu spezifesche Faserpopulatiounen iwwer all Muskeltypen an un Extremer vun der Muskelphysiologie auszeschléissen. Zum Beispill kënne mir d'Méiglechkeet net ausschléissen, datt eng Ënnergrupp vun ultraschnelle Faseren (z.B. reng 2X-Faseren) bei héichtrainéierte Sprinter an/oder Kraaftathleten79 oder während Perioden vun Muskelinaktivitéit66,80 optrieden. Ausserdeem huet déi limitéiert Proufgréisst vu Participanten eis dovun ofgehalen, Geschlechtsënnerscheeder an der Faserheterogenitéit z'ënnersichen, well bekanntlech ënnerscheedlech Fasertypverhältnisser tëscht Männer a Fraen optrieden. Ausserdeem konnten mir keng transkriptomesch an proteomesch Analysen op deeselwechte Muskelfaseren oder Prouwe vun deeselwechte Participanten duerchféieren. Well mir an anerer weiderhin d'Eenzelzell- an Eenzelmyofaser-Analysen mat Hëllef vun der Omik-Analyse optimiséieren, fir en ultra-niddrege Proufinput z'erreechen (wéi hei an der Analyse vu Fasere vu Patienten mat mitochondrialer Myopathie demonstréiert), gëtt d'Méiglechkeet, Multi-Omik- (a funktionell) Approche bannent eenzele Muskelfaseren ze kombinéieren, kloer.
Am Allgemengen identifizéieren an erklären eis Donnéeën transkriptionell a posttranskriptionell Faktoren, déi d'Heterogenitéit vu Skelettmuskelen verursaachen. Mir presentéiere speziell Donnéeën, déi en laangjäregt Dogma an der Physiologie vu Skelettmuskelen a Fro stellen, dat mat der klassescher MYH-baséierter Definitioun vu Fasertypen assoziéiert ass. Mir hoffen, d'Debatt nei opzebauen an letztendlich eist Verständnis vun der Klassifikatioun an Heterogenitéit vu Skelettmuskelfaseren nei ze iwwerdenken.
Véierzéng kaukasesch Participanten (12 Männer an 2 Fraen) hunn sech fräiwëlleg bereet erkläert, un dëser Studie deelzehuelen. D'Studie gouf vum Ethikkomitee vum Universitéitsspidol vu Gent (BC-10237) guttgeheescht, huet d'Helsinki-Deklaratioun vun 2013 erfëllt a gouf bei ClinicalTrials.gov (NCT05131555) registréiert. Allgemeng Charakteristike vun de Participanten sinn an der Ergänzungstabell 1 presentéiert. Nodeems se hir mëndlech a schrëftlech Zoustëmmung kritt hunn, hunn d'Participanten eng medizinesch Untersuchung gemaach, ier se endgülteg an d'Studie opgeholl goufen. D'Participanten ware jonk (22-42 Joer), gesond (keng medizinesch Zoustänn, keng Fëmmergeschicht) a mëttelméisseg kierperlech aktiv. Déi maximal Sauerstoffopnahm gouf mat engem Steppergometer bestëmmt fir d'kierperlech Fitness ze bewäerten, wéi virdru beschriwwen. 81
Muskelbiopsie-Prouwen goufen dräimol a Rou an am Nüchternzoustand gesammelt, mat engem Intervall vun 14 Deeg. Well dës Prouwen am Kader vun enger méi grousser Studie gesammelt goufen, hunn d'Participanten 40 Minutte virun der Biopsie e Placebo (Laktose), en H1-Rezeptor-Antagonist (540 mg Fexofenadin) oder en H2-Rezeptor-Antagonist (40 mg Famotidin) konsuméiert. Mir hunn virdru gewisen, datt dës Histaminrezeptor-Antagonisten d'Fitness vun de Rou-Skelettmuskelen net beaflossen81, an et gouf keng zoustandsbedingt Clustering an eise Qualitéitskontrolldiagrammer observéiert (Ergänzungsfiguren 3 an 6). Eng standardiséiert Ernährung (41,4 kcal/kg Kierpergewiicht, 5,1 g/kg Kierpergewiicht Kuelenhydrater, 1,4 g/kg Kierpergewiicht Protein an 1,6 g/kg Kierpergewiicht Fett) gouf 48 Stonnen virun all Experimentdag bäibehalen, an e standardiséierte Frühstück (1,5 g/kg Kierpergewiicht Kuelenhydrater) gouf moies vum Experimentdag konsuméiert. Ënner Lokalanästhesie (0,5 ml 1% Lidokain ouni Adrenalin) goufen Muskelbiopsien aus dem Vastus lateralis Muskel mat perkutaner Bergström Aspiratioun geholl.82 Muskelproben goufen direkt an RNAlater agebett a bei 4°C bis zur manueller Faserdissektion (bis zu 3 Deeg) gelagert.
Frësch isoléiert Myofaserbündel goufen an e frëscht RNAlater-Medium an enger Kulturschüssel transferéiert. Déi eenzel Myofaser goufen dann manuell mat engem Stereomikroskop an enger feiner Pinzette dissekéiert. Fënnefanzwanzeg Fasere goufen aus all Biopsie dissekéiert, mat besonnescher Opmierksamkeet op d'Auswiel vu Faseren aus verschiddene Beräicher vun der Biopsie. Nom Dissektion gouf all Faser virsiichteg an 3 μl Lysepuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) mat Proteinase K an DNase-Enzyme getippt, fir ongewollt Proteinen an DNA ze entfernen. D'Zelllys an d'Protein/DNA-Entfernung goufen dann duerch kuerz Vortexen, d'Dréie vun der Flëssegkeet an enger Mikrozentrifuge an d'Inkubatioun bei Raumtemperatur (10 Minutten) initiéiert. D'Lysat gouf dann an engem Thermocycler (T100, Bio-Rad) bei 37°C fir 5 Minutten, 75°C fir 5 Minutten inkubéiert an duerno direkt bei -80°C bis zur weiderer Veraarbechtung gelagert.
Illumina-kompatibel polyadenyléiert RNA-Bibliothéike goufen aus 2 µl Myofaserlysat mat dem QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) preparéiert. Detailéiert Methode kënnen am Handbuch vum Hiersteller fonnt ginn. De Prozess fänkt mat der Synthese vum éischte Strang cDNA duerch Reverse Transkriptioun un, bei där eenzegaarteg molekulare Identifizéierer (UMIs) a probespezifesch i1-Barcoden agefouert ginn, fir d'Pooling vu Proben ze garantéieren an d'technesch Variabilitéit während der Downstream-Veraarbechtung ze reduzéieren. cDNA aus 96 Myofaseren gëtt dann zesummegefaasst a mat Magnéitperlen gereinegt, duerno gëtt d'RNA ewechgeholl an d'Zweetstrangsynthese mat zoufällege Primer duerchgefouert. D'Bibliothéik gëtt mat Magnéitperlen gereinegt, poolspezifesch i5/i7 Tags ginn derbäigesat, an PCR-amplifizéiert. E leschte Reinigungsschratt produzéiert Illumina-kompatibel Bibliothéiken. D'Qualitéit vun all Bibliothéikspool gouf mat dem High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) bewäert.
Baséierend op der Qubit-Quantifizéierung goufen d'Pools weider bei equimolare Konzentratiounen (2 nM) zesummegefaasst. De resultéierende Pool gouf dann op engem NovaSeq 6000 Instrument am Standardmodus mat dem NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 Nukleotiden) mat 2 nM Ladung (4% PhiX) sequenzéiert.
Eis Pipeline baséiert op der QuantSeq Pool Datenanalysepipeline vu Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). D'Donnéeë goufen als éischt mat bcl2fastq2 (v2.20.0) baséiert op dem i7/i5 Index demultiplexéiert. Liesung 2 gouf dann mat idemux (v0.1.6) baséiert op dem i1 Prouf Barcode demultiplexéiert an UMI Sequenze goufen mat umi_tools (v1.0.1) extrahéiert. D'Liesunge goufen dann a verschiddene Ronne mat cutadapt (v3.4) ofgeschnidden fir kuerz Liesungen (<20 an der Längt) oder Liesungen ze läschen, déi nëmmen aus Adaptersequenzen bestoen. D'Liesunge goufen dann mam mënschleche Genom mat STAR (v2.6.0c) ausgeriicht an d'BAM Dateie goufen mat SAMtools (v1.11) indexéiert. Duebel Liesunge goufen mat umi_tools (v1.0.1) ewechgeholl. Schlussendlech gouf d'Ausriichtungszielung mat featureCounts a Subread (v2.0.3) duerchgefouert. D'Qualitéitskontroll gouf mat FastQC (v0.11.9) a verschiddenen Zwëschenstadien vun der Pipeline duerchgefouert.
All weider bioinformatesch Veraarbechtung a Visualiséierung goufen an R (v4.2.3) duerchgefouert, haaptsächlech mat dem Seurat (v4.4.0) Workflow. 83 Dofir goufen individuell UMI-Wäerter a Metadatenmatrizen an Seurat-Objeten transforméiert. Genen, déi a manner wéi 30% vun alle Faseren expriméiert goufen, goufen ewechgeholl. Prouwe vu schlechter Qualitéit goufen op Basis vun engem Mindestschwellwäert vun 1000 UMI-Wäerter an 1000 detektéierte Genen ewechgeholl. Schlussendlech hunn 925 Faseren all Qualitéitskontrollfilterschrëtt bestanen. D'UMI-Wäerter goufen mat der Seurat SCTransform v2 Method normaliséiert, 84 mat all 7418 detektéierte Funktiounen, an Ënnerscheeder tëscht de Participanten goufen regresséiert. All relevant Metadaten kënnen am Ergänzungsdatensatz 28 fonnt ginn.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 10. September 2025